實時熒光定量PCR工作原理

更新時間：2021-01-08

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實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）

基本原理

qPCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應(yīng)的進行，擴增產(chǎn)物不斷積累，導(dǎo)致熒光信號不斷積累，從而利用熒光信號的變化實時監(jiān)測整個 PCR 進程。
根據(jù) PCR 定量原理公式可推導(dǎo)出，模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)與閾值循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，模板起始拷貝數(shù)越多，熒光信號達到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光基團發(fā)出的熒光強度與 PCR 擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈對應(yīng)關(guān)系，只要對熒光信號進行實時監(jiān)測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算未知樣品的起始拷貝數(shù)。
Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)。相同模板進行 96 次擴增，終點處產(chǎn)物量不恒定，但 Ct 值卻重現(xiàn)性。

模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環(huán)數(shù)越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。

目前常用熒光標(biāo)記方法

方法	優(yōu)點	缺點	應(yīng)用范圍
SYBR Green I	適用性廣靈敏方便便宜	引物要求高易出現(xiàn)非特異條帶	科研中對各種目的基因定量分析，基因表達量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動植物研究
Taqman	特異性高重復(fù)性好	價格高只適合特定目標(biāo)	病原體檢測，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷
分子信標(biāo)	高特異性熒光背景低	只適合特定目標(biāo) 設(shè)計困難價格高	特定基因分析，SNP分析

熒光定量 PCR 反應(yīng)體系舉例
試劑	含量
2xGoTaq Master Mix	5µl
無核酸酶水	3.5µl
上游引物	0.25µl
下游引物	0.25µl
基因組 DNA	1µl（約20ng）梯度稀釋
共 10µl

儀器與耗材

在普通 PCR 儀的基礎(chǔ)上增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴增原理和普通 PCR 儀擴增原理相同，只是 PCR 擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng)得出量化的實時結(jié)果輸出，把這 PCR 儀叫做實時熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時候，選用單通道，有多熒光標(biāo)記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標(biāo)記的目的基因表達產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫(yī)學(xué)臨床檢測，生物醫(yī)藥研發(fā)，食品行業(yè)，科研院校等機構(gòu)。

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