知曉PCR，定量PCR與數(shù)字PCR的實驗方法與選擇

更新時間：2021-01-09

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從1985年至今的30多年時間里，PCR分析經(jīng)歷了三代技術的發(fā)展。一代傳統(tǒng)PCR技術，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對PCR產(chǎn)物進行定性分析。第二代熒光定量PCR技術，通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)控PCR進程，后用Cq值對基因進行定量分析。第三代數(shù)字PCR技術，通過將PCR反應液進行有限稀釋，實現(xiàn)核酸分子的單分子擴增，終采取終點法檢測陽性微滴的熒光信號，有熒光信號的微滴判讀為 1；沒有熒光信號的微滴判讀為 0，因此該技術被稱為數(shù)字PCR。

PCR技術在不斷地蛻變卻從未淡出我們的視野，如今已經(jīng)滲透到分子生物學領域的各種研究層面。尤其在今年大流行疾病中，展現(xiàn)了PCR技術的強大之處。那在科學研究中，我們該如何選擇傳統(tǒng)PCR 、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR呢？

首先我們要清楚，三代PCR技術所有的基礎源于PCR反應的基本原理和PCR反應的3個重要階段，分別是指數(shù)期、線性期和平臺期。

指數(shù)期

指數(shù)期內(nèi)，每個循環(huán)PCR產(chǎn)物量大約增加1倍（假定 100%反應效率），該階段的擴增反應具有高度特異性和精度。

線性期（高變異性）

隨著PCR反應體系成分的消耗，其中的一個或者多種成分限制反應，導致反應開始減緩，并且每個循環(huán)的PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺期

反應停止，不再產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。因為每個樣品具有不同的反應動力學，所以每個反應將在不同的時間點進入平臺期，平臺期內(nèi)可以看到這些差異。

傳統(tǒng) PCR

傳統(tǒng)PCR通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR終產(chǎn)物進行分析（圖2），它的局限性就在于只能做定性分析。在圖3中，3個反應孔含有相同量的 DNA模板，但到達平臺期后產(chǎn)生的熒光信號卻不同，說明擴增產(chǎn)物的量存在不同（反應動力學變化所致）。這也表明了傳統(tǒng)PCR平臺期測量時結(jié)果存在變異，產(chǎn)出的DNA量不一定能反映初情況，所以無法進行定量。

熒光定量 PCR

同樣在圖3中，發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期內(nèi)，3個反應孔的擴增曲線*重合，說明指數(shù)期內(nèi)進行檢測將更加確，可實現(xiàn)更加準確的定量。閾值線是擴增產(chǎn)物熒光強度超過背景時的一個熒光強度值，樣品達到此熒光強度值所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)稱為Cq值。通過比較未知濃度的樣品與一系列標準品的Cq值，可以測定未知反應中的模板 DNA數(shù)量。

數(shù)字 PCR

數(shù)字 PCR 是通過將樣本DNA隨機分布至獨立的反應單元中，每個反應單元中包含或者不包含1個或多個拷貝的目標分子，所有獨立的反應單元進行平行擴增后，對每個反應單元的陰性或者陽性熒光信號進行檢測并進行統(tǒng)計學分析，就可以計算出原始樣本的拷貝數(shù)，無需參考標準品或內(nèi)源性對照品，也不需要標準曲線。

傳統(tǒng)PCR 、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR的選擇

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