實時熒光定量PCRReal-time PCR 工作原理

更新時間：2021-03-28

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理論基礎(chǔ)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)作為一種革命性的方法在生物學(xué)研究的歷史中占據(jù)了重要的地位。以此為基礎(chǔ)發(fā)展出包括real-time PCR在內(nèi)的多項應(yīng)用技術(shù)。自誕生后real-time PCR技術(shù)持續(xù)發(fā)展，從簡單的增擴到整個PCR過程，real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感、更明確的定量分析特性和對識別等位基因的能力。

不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個循環(huán)增擴曲線的增長。事實并非如此，早期的軟件不能在運行期間提供可視化的增擴曲線。主要是因為SDS軟件采用整個平臺最終的數(shù)據(jù)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析工作，而不是分析每個單獨的反應(yīng)循環(huán)。對某些設(shè)備來說，必須向分析軟件提供實時的最終的數(shù)據(jù)，有些設(shè)備則不需要。前一種設(shè)備允許軟件實時跟蹤每個加樣口的增擴曲線，同時顯示在電腦屏幕上。Real-time PCR其實是一種real-time設(shè)備。

RNA定量分析依靠逆轉(zhuǎn)錄酶制作cDNA（complementary DNA）。常見的逆轉(zhuǎn)錄酶有2種，AMV和MMLV。AMV是一種鳥類myeloblastosis病毒的二聚體蛋白質(zhì)，MMLV來自于鼠科leukemia病毒的monomeric蛋白。2種酶都有RNase把RNA變性為RNA-DNA雜交體的活性，比較而言AMV有更高的RNase H活性。RNase H活性和依賴于RNA的DNA聚合酶活性能被mutagenesis區(qū)分開來。更重要的是每個AMV能把較多的分子聚攏在一起，推動增擴反應(yīng)的進行。原生的AMV有高于MMLV的適用溫度，42?C對37?C。修改后的變種可以有更高的溫度極限，分別是AMV58?C，MMLV55?C。

按照以上的描述，大家可能認(rèn)為改造后的AMV是適宜從RNA制作cDNA的酶。然而，在實際使用中經(jīng)改造的MMLV工作的較好。其中的原因目前仍不明，猜測高溫破壞了2種酶的聚合酶活性，但殘留的DNA綁定活性對Taq polymerase形成物理障礙。二聚體構(gòu)象和較高的溫度極限也許使得AMV表現(xiàn)不佳。出于這個原因應(yīng)在實驗中盡可能少的使用逆轉(zhuǎn)錄酶。需要強調(diào)的是即使沒有引物cDNA仍然能被逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制造出來，RNA模板的二級結(jié)構(gòu)可能自我引發(fā)反應(yīng)。有3種方法可以準(zhǔn)備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：oligo-dT，random primers or assay-specific primers。其中oligo-dT的使用較廣泛，它使用mRNAs作為模板。但是不是所有mRNA都有poly-A尾，最大的問題是oligo-dT把增擴區(qū)域限制在了mRNA poly-A 尾的附近。當(dāng)轉(zhuǎn)錄較長的片段時（<500bp）反應(yīng)開始于3’ UTR。這樣的結(jié)果有高的忠實性，也意味著增擴出的序列可能不會跨過一個外顯子連接。對于有些實驗，3’ UTR富含不利于PCR實驗的A/T堿基。因此使用自由引物制造轉(zhuǎn)錄序列放棄3’ UTR，但自由引物也同時會制造核糖體和transfer RNAs的cDNA，出現(xiàn)大量且復(fù)雜的cDNA。第三種方法是使用針對每個實驗的引物（assay-specific primers），理論上講這種引物滿足轉(zhuǎn)錄目標(biāo)序列的要求，得到相應(yīng)的cDNA產(chǎn)物。

Real-time PCR反應(yīng)增擴子的最大長度大約在250 bases，從前面的討論可知assay-specific primers是大多數(shù)實驗較佳的選擇。但是assay-specific primers有2個明顯的缺點，每次PCR反應(yīng)使用較多的RNA樣本，不能用于一臺儀器上同時處理幾種樣本的反應(yīng)。注意根據(jù)實驗需要合理的選擇引物，安排實驗計劃。

現(xiàn)代PCR反應(yīng)的核心是耐熱DNA聚合酶，常用的是Thermus aquaticus也稱Taq。野生型Taq是依賴DNA從5->3合成的，具有3->5校對功能的聚合酶，它也有5’-nuclease的活性。Real-time PCR常用變異后移除校對功能的品種。市場上有2種版本的Taq，修改后的Taq和熱啟動（hot start）Taq。

現(xiàn)今市場上的real-time PCR設(shè)備均使用熒光劑作為信號源，熒光的強度隨著增擴產(chǎn)物的增加而成比例的增長。熒光劑分子吸收光線中狹小波長的光子，能被染料吸收的光線叫做激發(fā)波長。激發(fā)后的分子處于較高的能量狀態(tài)，持續(xù)時間很短，分子迅速衰退到原先的狀態(tài)。在這個過程中一個光子以較長的波長發(fā)散出來，對于每一個熒光染料都有一個優(yōu)化的激發(fā)和發(fā)散波長。在狹窄的優(yōu)化波長范圍內(nèi)，熒光分子能被激發(fā)或檢測到。熒光實驗主要要求在最初和最后的10個PCR循環(huán)中信號強度有盡可能大的差異。熒光劑染料分子（donor或reporter）由外部的優(yōu)化波長光線激活后，釋放出較長波的光線去激活臨近的另一個分子（acceptor），這樣的過程稱為三角洲。接受光線的分子可能會也可能不會釋放出光線。每一次的轉(zhuǎn)發(fā)過程都會使波長有所增加，直至real-time設(shè)備能接收到。Real-time PCR的熒光劑按照功能區(qū)分有3個類型，1. Donor發(fā)散出的熒光信號在實驗過程中被檢測到。2. Acceptor負(fù)責(zé)冷卻Donor發(fā)出的信號。3. 是參照染料，參照染料不與其他成分產(chǎn)生反應(yīng)，軟件用它校正不同加樣孔的信號。理論上講，熒光劑染料可以成為reporter。常見的染料有6-FAM (6-carboxy fluorescein)和YBR® Green I，前一種能被由氬離子激光制造的488 nm的波長激發(fā)。6-FAM容易和寡核苷酸結(jié)合釋放出一個強信號。YBR® Green I與6-FAM不同，是一種自由染料。

冷卻分子可以是熒光染料也可以是其他能吸收恰當(dāng)波長的光線能量的分子，原來和6-FAM一起使用的是TAMRA (6-carboxy-tetramethylrhodamine)。FAM在靠近TAMAR的位置上有效地吸收光子能量。除此之外，不發(fā)光的黑色染料也可用于reporter。常見的有DABSYL (4-(dimethylamino)azobenzene-4’-sulfonyl chloride)。參照組的熒光信號比較每個加樣孔的不同，保證每個加樣孔的信號在整體上較平穩(wěn)。設(shè)備上的不同會形成加樣孔之間數(shù)值的偏差，叫做“邊緣效應(yīng)”，要求對每個加樣孔的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化。但是當(dāng)邊緣效應(yīng)過大，內(nèi)側(cè)加樣孔和外側(cè)加樣孔的差距過大就不再適合參照組作為標(biāo)準(zhǔn)化的依據(jù)。常見的參照染料是ROX (6-carboxy-X-rhodamine)