常用蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法匯總

 蛋白質(zhì)是細(xì)胞中最重要的含氮生物大分子之一，承擔(dān)著各種生物功能。蛋白質(zhì)的定量分析是蛋白質(zhì)構(gòu)造分析的基礎(chǔ)。目前常用的蛋白測(cè)量的方法主要有BCA法、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)和Lowry法等。

  BCA法  

 原理

 在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+(biuret reaction)。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.按試劑盒說(shuō)明書(shū)配置BCA工作液；

2.完溶解蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，按照說(shuō)明書(shū)要求對(duì)標(biāo)品進(jìn)行梯度稀釋，加入BCA工作液，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度；

3.以樣品濃度為X軸，吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

4.待測(cè)樣品中加入BCA工作液，測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品濃度。

  與Lowery法相比，BCA蛋白測(cè)定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。

  考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)法  

 原理

 考馬斯亮藍(lán)G-250(Coomassie brilliant blue G-250)測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.按試劑盒說(shuō)明書(shū)配置Bradford染液；

2.全溶解蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，按照說(shuō)明書(shū)要求對(duì)標(biāo)品進(jìn)行梯度稀釋，加入染液和染料結(jié)合液后，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度；

3.以標(biāo)品濃度為X軸，吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

4.各孔中加入染液和染料結(jié)合液，測(cè)定樣品吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品濃度。

 Bradford法試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/mL，最小可測(cè)2.5μg/mL蛋白質(zhì)。

   斐林—酚試劑(Lowry)法   

 原理

 斐林(Folin)-酚試劑法結(jié)合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，其中包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，與銅試劑作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物;第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，生成磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)的深藍(lán)色混合物，顏色深淺與蛋白含量成正相關(guān)，在650nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。

 實(shí)驗(yàn)步驟

 與上述兩種方法大致相同

 LORRY法靈敏度高,重復(fù)性好，適于5～l00μg蛋白質(zhì)的定量，耗時(shí)長(zhǎng)，操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中要特別注意排除還原物質(zhì)、檸檬酸等的干擾作用才能得到最準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 這幾種方法共同點(diǎn)在于，都需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣品往往數(shù)量較多，為了縮短實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，保證測(cè)量準(zhǔn)確性，可使用酶標(biāo)儀對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定。