賽默飛Thermo酶標(biāo)儀的使用方法

一、測定波長
目前國內(nèi)常見的ELISA試劑盒所使用的標(biāo)記用酶均為辣根過氧化物酶（HRP），底物通常為四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和鄰苯二胺（OPD），其在過氧化氫溶液的存在下，經(jīng)HRP作用，分別氧化為2,2,-二氨基偶氮苯（DAB）和聯(lián)苯醌。當(dāng)pH值為5.0左右時(shí)，DAB在450nm波長處有最大吸收，當(dāng)pH值降為L 0時(shí)，最大吸收波長移至492 nm,同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深，因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng)。TMB的氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有最大消光系數(shù)，如果HRP量少，H:O:和TMB過量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽離子根。降低pH,即可使藍(lán)色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌，使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min.因此，450nm和492 nm兩個(gè)波長是目前ELISA測定常用的。各種酶標(biāo)儀都配有放置濾光片的可自動(dòng)轉(zhuǎn)換的部件，可以同時(shí)安裝6~8片濾光片，所配備的濾光片均應(yīng)包括上述兩個(gè)波長，有的酶標(biāo)儀以490nm濾光片替代492nm濾光片，影響不大    一般酶標(biāo)儀的測定波長在400~750nm或800nm之間，可以滿足ELISA的顯色測定。。除了這兩個(gè)基本濾光片外，考慮到雙波長比色的需要，還應(yīng)有620nm或630nm或650nm和405nm波長的濾光片，其他濾光片可根據(jù)自己的需要選擇。有時(shí)，有的實(shí)驗(yàn)室希望用酶標(biāo)儀作微量生化測定，故酶標(biāo)儀生產(chǎn)廠家對(duì)其生產(chǎn)的酶標(biāo)儀擴(kuò)展了紫外檢測功能，此時(shí)需要一個(gè)340nm波長濾光片。此時(shí)，酶標(biāo)儀的測定波長范圍就成為340-750nm或800nm。
酶標(biāo)儀有單波長和雙波長檢測功能有時(shí)使用者不知在什么情況下使用單或雙波長檢測。所謂的“單波長"就是使用一種對(duì)顯色具最大吸收的波長即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測定；而“雙波長"則除了用對(duì)顯色具最大吸收的波長即450 nm或492 nm進(jìn)行比色測定外，同時(shí)用對(duì)特異顯色不敏感的波長如630 nm進(jìn)行測定，酶標(biāo)儀最后打印出來的吸光度則為二者之差。630 nm波長下得到的吸光度是非特異的，來自于板子上諸如指紋、灰塵、臟物等所致的吸收。因此，在ELISA比色測定中，最好使用雙波長，且不必設(shè)空白孔。

二、測定的吸光度范圍   
通常，酶標(biāo)儀的吸光度測定范圍在。0-2.5之間即可以滿足ELISA的測定要求。早期的酶標(biāo)儀可測定的吸光度一般在0-2.5之間，但現(xiàn)在基本上都做了拓寬，可達(dá)到3.5以上，并且能保持很好的精密度與線性。如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2的吸光度測定范圍為0-3.5，而Multiskan Ascent的吸光度測定范圍（Abs）達(dá)0-4.0，在0-4.0范圍，線性誤差不超過±2.0%，在0.3-3.0吸光度范圍內(nèi)，測定精密度CV小于±0.2%；3.0-4.0 Abs范圍內(nèi)，測定精密度CV小于士0.2%。因此，對(duì)于酶標(biāo)儀的吸光度范圍不必去刻意追求大的吸光度范圍，主要要看在一定的吸光度范圍內(nèi)的線性和精密度如何。

三、光學(xué)系統(tǒng)   
酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)采用的是垂直光路多通道（通常為8或12通道，亦有單通道）檢測，一般為硅光管或光導(dǎo)纖維，除測定通道外，有的酶標(biāo)儀還有一個(gè)參比通道，每次測定可進(jìn)行自我校準(zhǔn)。酶標(biāo)儀的光學(xué)系統(tǒng)功能如何，均可通過酶標(biāo)儀測定的吸光度范圍、線性度、精密度和準(zhǔn)確度等體現(xiàn)出來。光學(xué)系統(tǒng)好的話，則上述指標(biāo)也應(yīng)較佳。測定的精密度與測定通道之間的均一性有直接關(guān)系。單通道可避免因通道不同所致的差異。

四、檢測速度   
酶標(biāo)儀的檢測速度是指其完成比色測定所需要的時(shí)間。檢測速度快，有利于提高檢測的精密度，即避免由于測定過程中，因測定時(shí)間不同所致的各微孔間吸光度間的差異。目前市場上常見的酶標(biāo)儀檢測速度都非常快，通常在數(shù)秒鐘內(nèi)，如Labsystems公司Dragon Wellscan MK-2和MK-3檢測96孔只需2s（連續(xù)模式）或5s（步進(jìn)模式）。Multiskan Ascent為單通道檢測，亦只需9s（連續(xù)模式）或14s（步進(jìn)模式）。又如BioRad公司的Benchmark的檢測速度單波長為7s，雙波長為15s。

五、震板功能    
酶標(biāo)儀的震板功能是指酶標(biāo)儀在對(duì)ELISA板孔進(jìn)行比色測定前對(duì)其進(jìn)行振蕩混勻，使板孔內(nèi)顏色均一。目前市場上常見的酶標(biāo)儀均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋轉(zhuǎn)等方式及振蕩幅度等任意調(diào)節(jié)，如Labsystems的MK-2；有的則較為固定，如BioRad 550。使用有震板功能的酶標(biāo)儀，在進(jìn)行ELISA測定顯色反應(yīng)完成加入終止劑后，可不必振蕩混勻，直接放人酶標(biāo)儀上測定即可。

六、溫育功能   
溫育功能是指酶標(biāo)儀本身能按要求自動(dòng)精確地控制儀器內(nèi)部的溫度，使得ELISA測定中微孔板條的溫育過程可在儀器內(nèi)部完成，而無需再外配溫箱。目前，只有少部分酶標(biāo)儀具有此種功能。

七、軟件功能   
軟件功能是指酶標(biāo)儀所具有的對(duì)ELISA定性和定量測定及其他測定方式如酶標(biāo)動(dòng)力學(xué)、紫外和凝集等數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析并報(bào)告結(jié)果的功能。軟件功能是中高檔酶標(biāo)儀的一個(gè)非常重要的功能。如果硬件方面區(qū)別不大，則軟件就成為判定酶標(biāo)儀優(yōu)劣的惟一指標(biāo)。對(duì)于用戶來說，好的軟件功能，對(duì)實(shí)際工作會(huì)有較大的幫助。